各省、自治區(qū)、直轄市藥品監(jiān)督管理局：

    為防止肝炎、艾滋病等血源性傳播疾病隨血液制品的應(yīng)用而傳播，保證臨床使用安全，我局組織有關(guān)單位和專家制定了《血液制品去除／滅活病毒技術(shù)方法及驗(yàn)證指導(dǎo)原則》，現(xiàn)予印發(fā)，請(qǐng)遵照?qǐng)?zhí)行并轉(zhuǎn)發(fā)至轄區(qū)內(nèi)各有關(guān)單位。

   

國(guó)家藥品監(jiān)督管理局

二○○二年五月九日

    目前已知經(jīng)血液制品傳染的病毒主要有HBV、HCV、HIV-1、HIV-2、HTLV和細(xì)小病毒B19。尚未發(fā)現(xiàn)經(jīng)血液制品傳染CJD。但有少數(shù)研究報(bào)告發(fā)現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)性傳染現(xiàn)象，因此要密切關(guān)注CJD，特別是vCJD的發(fā)展動(dòng)向。

    為了提高血液制品安全性，生產(chǎn)工藝要具有一定的去除/滅活部分病毒能力，生產(chǎn)過(guò)程中應(yīng)有特定的去除/滅活病毒方法。本技術(shù)指導(dǎo)原則是對(duì)血液制品（指以人血漿為原料制備的制品）生產(chǎn)過(guò)程以及特定的去除/滅活病毒方法驗(yàn)證的指導(dǎo)原則，包括指示病毒和病毒去除/滅活方法的選擇、驗(yàn)證方案的設(shè)計(jì)、結(jié)果判定以及附錄所列技術(shù)驗(yàn)證申報(bào)的程序。

    由于不同類血液制品潛在的污染病毒的可能性不同，為此選擇病毒去除/滅活方法的側(cè)重點(diǎn)也應(yīng)有所不同：

    （一）凝血因子類制品

    生產(chǎn)過(guò)程中應(yīng)有特定的能去除/滅活脂包膜和非脂包膜病毒的方法，可采用一種或多種方法聯(lián)合去除/滅活病毒。

    （二）免疫球蛋白類制品

    對(duì)于免疫球蛋白類制品（包括靜脈注射用人免疫球蛋白、人免疫球蛋白和特異性人免疫球蛋白）生產(chǎn)過(guò)程中應(yīng)有特定的滅活脂包膜病毒方法。但從進(jìn)一步提高這類制品安全性考慮，提倡生產(chǎn)過(guò)程中加入特定的針對(duì)非脂包膜病毒的去除/滅活方法。

    （三）白蛋白

    采用低溫乙醇生產(chǎn)工藝和特定的去除/滅活病毒方法，如巴斯德消毒法等。

    （一）巴斯德消毒法（巴氏消毒法）

    1．人血白蛋白制品

    幾十年臨床應(yīng)用結(jié)果表明，白蛋白的巴氏消毒法對(duì)HIV和肝炎病毒是安全的。其病毒滅活條件已很完善，可不要求進(jìn)行病毒滅活驗(yàn)證。但是必須對(duì)巴氏消毒法所用設(shè)施進(jìn)行驗(yàn)證，使巴氏消毒各參數(shù)符合要求（包括制品內(nèi)溫度分布的均一性和滅活時(shí)間）。

    2．其它血液制品（液體制劑）

    由于制品的組成、穩(wěn)定劑（如：氨基酸、糖、枸櫞酸鹽等）及其濃度的不同，均會(huì)對(duì)滅活病毒效果有一定的影響。因此在采用巴氏消毒滅活病毒方法時(shí)必須進(jìn)行病毒滅活效果驗(yàn)證。

    （二）干熱法（凍干制品）

    80℃加熱72小時(shí)，可以滅活HBV、HCV、HIV和AV等病毒。但應(yīng)考慮制品的水分含量、制品組成（如：蛋白質(zhì)、糖、鹽和氨基酸）對(duì)病毒滅活效果的影響。應(yīng)確定允許的制品瓶間各參數(shù)的差異。病毒滅活用的干熱箱至少每半年驗(yàn)證一次。驗(yàn)證時(shí)干燥箱內(nèi)應(yīng)設(shè)多個(gè)測(cè)溫點(diǎn)（包括制品內(nèi)、箱內(nèi)最高和最低溫度點(diǎn)）。

    （三）有機(jī)溶劑/去污劑（S/D）處理法

    有機(jī)溶劑，如：磷酸三丁脂（TNBP）和非離子化的去污劑，如：ritonX-100或吐溫-80結(jié)合可以滅活脂包膜病毒，但對(duì)非脂包膜病毒無(wú)效。常用的滅活條件是0.3% TNBP和1%吐溫-80，在24℃處理至少6小時(shí)；0.3%TNBP和1%riton X-100，在24℃處理至少4小時(shí)。S/D處理前應(yīng)先用1μm濾器除去蛋白溶液中可能存在的顆粒（顆粒可能藏匿病毒從而影響病毒滅活效果）。加入S/D后應(yīng)確保是均一的混合物。在滅活病毒全過(guò)程中應(yīng)將溫度控制在規(guī)定的范圍內(nèi)。如果在加入S/D后過(guò)濾，則須檢測(cè)過(guò)濾后S/D的濃度是否發(fā)生變化，如有變化應(yīng)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。吐溫-80應(yīng)采用植物源性，并應(yīng)采用稱量法量取。

    （四）膜過(guò)濾法

    膜過(guò)濾技術(shù)只有在濾膜的孔徑比病毒有效直徑小時(shí)才能有效除去病毒。該方法不能單獨(dú)使用，應(yīng)與其它方法聯(lián)合使用。

    驗(yàn)證研究時(shí)應(yīng)考慮蛋白溶液的濃度、濾速、壓力和過(guò)濾量等重要參數(shù)。在過(guò)濾前及過(guò)濾后應(yīng)測(cè)試濾膜的完整性。

    （五）低pH孵放法

    研究表明，免疫球蛋白生產(chǎn)工藝中的低pH（如pH=4）處理（有時(shí)加胃酶）能滅活幾種脂包膜病毒。滅活條件（如：pH值、孵放時(shí)間和溫度、胃酶含量、蛋白質(zhì)濃度、溶質(zhì)含量等因素）可能影響病毒滅活效果，驗(yàn)證試驗(yàn)應(yīng)該研究這些參數(shù)允許變化的幅度。

    （一）指示病毒的選擇

    首先，應(yīng)該選擇經(jīng)血液傳播的相關(guān)病毒（如：HIV），不能用相關(guān)病毒的，要選擇與其理化性質(zhì)盡可能相似的指示病毒；第二，所選擇的病毒理化性質(zhì)應(yīng)有代表性（病毒大小、核酸類型以及有無(wú)包膜），其中至少應(yīng)包括一種對(duì)物理和/或化學(xué)處理有明顯抗性的病毒。在進(jìn)行去除/滅活病毒驗(yàn)證時(shí)，應(yīng)根據(jù)制品的特性及所采用的病毒去除/滅活工藝，參照下表列舉的病毒選擇適宜的指示病毒。所選擇的指示病毒至少應(yīng)包括HIV-1、HBV和HCV模擬病毒以及非脂包膜病毒。水皰性口炎病毒（VSV）耐受的p范圍比較廣，驗(yàn)證低p孵放法滅活病毒效果時(shí)可選用此指示病毒。

    （二）方案設(shè)計(jì)

    1．去除/滅活病毒驗(yàn)證研究應(yīng)符合GLP的要求。

    2．研究影響去除/滅活病毒效果的參數(shù)（包括機(jī)械參數(shù)和理化參數(shù)）允許變化的幅度。

    3．研究病毒滅活動(dòng)力學(xué)，包括病毒滅活速率和滅活曲線。

    4．指示病毒滴度應(yīng)該盡可能高（病毒滴度應(yīng)≥10⁶/ml）。

    5．加入的病毒與待驗(yàn)證樣品體積比不能高于1∶9。

    6．如可能，驗(yàn)證過(guò)程中每步取出的樣品應(yīng)盡快直接進(jìn)行病毒滴定，不做進(jìn)一步處理（如超離心、透析或保存、除去抑制劑或毒性物質(zhì)等）。如果樣品必須做進(jìn)一步處理，或不同時(shí)間取出的樣品要在同一時(shí)間進(jìn)行測(cè)定，應(yīng)考慮這些處理方法對(duì)病毒檢測(cè)結(jié)果的影響。

    7．檢測(cè)方法可包括蝕斑形成、細(xì)胞病變（如合胞體或病灶形成）、終點(diǎn)滴定或其他方法。這些方法應(yīng)該有適宜的靈敏度和可重復(fù)性，每一個(gè)取樣點(diǎn)應(yīng)取雙份樣品并設(shè)有對(duì)照以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

    8．如果制品的生產(chǎn)工藝中包含了兩步或兩步以上病毒去除/滅活方法，應(yīng)該分別進(jìn)行病毒滅活效果驗(yàn)證。

    （三）觀察指標(biāo)

    1．病毒方面

    （1）去除/滅活病毒滴度；

    （2）滅活病毒速率、滅活曲線。以列表和做圖形式報(bào)告驗(yàn)證結(jié)果。

    2．病毒去除/滅活各參數(shù)允許變化范圍

    3．蛋白質(zhì)方面

    （1）制品質(zhì)量應(yīng)符合《中國(guó)生物制品規(guī)程》或有關(guān)規(guī)定；

    （2）采用適當(dāng)方法測(cè)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能活性的變化。如：制品比活性、HIVIG的Fc功能分析可了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是否發(fā)生了變化；凝膠色譜法可檢測(cè)蛋白質(zhì)分子大小和形狀的變化；蛋白質(zhì)形狀變化可導(dǎo)致擴(kuò)散系數(shù)、沉降常數(shù)和粘度的改變；SDS-PAGE，特別是等電聚焦和PAGE結(jié)合（雙向電泳）也是檢測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的很好方法。

    （3）如果采用新的去除/滅活方法（包括更換使用已認(rèn)可的病毒滅活方法或國(guó)內(nèi)外未曾采用過(guò)的病毒去除/滅活方法），需對(duì)蛋白質(zhì)半衰期和新免疫原性進(jìn)行研究。要求如下：半衰期：用適宜動(dòng)物（如大鼠或家兔）和未經(jīng)病毒去除/滅活的相同制品進(jìn)行半衰期比較；新免疫原性：新免疫原性用來(lái)檢查蛋白質(zhì)較高級(jí)別結(jié)構(gòu)上的變化。這些變化不一定損害蛋白質(zhì)功能，但是會(huì)引起受體免疫反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)新免疫原性是非常困難的�？捎媒�(jīng)和未經(jīng)病毒滅活的蛋白分別免疫動(dòng)物（如家兔），所產(chǎn)生的抗體交叉用未經(jīng)和經(jīng)病毒滅活的蛋白結(jié)合。如果經(jīng)病毒滅活的蛋白抗體被未經(jīng)病毒滅活的蛋白完全結(jié)合，說(shuō)明不含新抗原。由于不能保證人類免疫系統(tǒng)識(shí)別的表位與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相同，因此推薦在Ⅳ期臨床（獲得生產(chǎn)文號(hào)后）開(kāi)展是否有新抗原產(chǎn)生的研究。

    （四）效果的判定

    判斷病毒去除/滅活的有效性須綜合考慮，不能僅以病毒去除/滅活的量來(lái)確定。在確定有效之前，必須考慮如下因素，審慎評(píng)價(jià)每次驗(yàn)證結(jié)果。

    1．驗(yàn)證試驗(yàn)所選擇的病毒是否適宜，病毒驗(yàn)證的設(shè)計(jì)是否合理。

    2．病毒降低量（log₁₀  ）≥4 logs，表示該步驟去除/滅活病毒有效。如因檢測(cè)方法造成病毒降低量＜4 logs時(shí)，應(yīng)盲傳三代，如無(wú)病毒檢出，可認(rèn)定是有效的滅活病毒方法。

    3．病毒滅活動(dòng)力學(xué)可更好的顯示病毒滅活的效果。病毒滅活通常不是簡(jiǎn)單的一級(jí)反應(yīng)。往往是起始反應(yīng)速率快，其后變慢。如果病毒滅活速率隨時(shí)間明顯降低，表示該方法可能無(wú)效，或者殘留的指示病毒對(duì)該滅活方法有抵抗力，說(shuō)明該步病毒滅活方法無(wú)效。

    4．病毒實(shí)際滴度為基礎(chǔ)病毒，指示病毒與樣品1∶9的比例混勻后零點(diǎn)取樣的病毒滴度，通過(guò)與經(jīng)去除/滅活病毒后的測(cè)定的實(shí)際病毒殘留量的比較，作為該病毒去除/滅活方法（步驟）實(shí)際的滅活病毒的量。

    5．病毒檢測(cè)敏感度的限值。

    舉例說(shuō)明：

    （1）加入6 logs 病毒，剩余4 logs 病毒，可將去除/滅活病毒的log數(shù)計(jì)算在生產(chǎn)全過(guò)程中去除/滅活病毒總量之中，但是就此步（方法）去除/滅活病毒能力而言是無(wú)效的。

    （2）加入6 logs 病毒，但由于制品本身的細(xì)胞毒作用使得檢測(cè)靈敏度限值為4 logs ，僅證明除去2 logs 的病毒。在此種情況下需改變?cè)囼?yàn)設(shè)計(jì)重新進(jìn)行驗(yàn)證。

    （3）加入6 logs 病毒，但仍可測(cè)定2 logs 的剩余病毒，且清除病毒的量可重復(fù)出，并不受工藝的影響，應(yīng)認(rèn)為是有效的去除/滅活病毒的方法。

    （4）加入 6 logs病毒 ，之后未檢測(cè)出病毒。但是由于檢測(cè)靈敏度限值為2 logs ，僅能認(rèn)為大約清除或滅活了4 logs 病毒。事實(shí)上可能等于或大于4 logs ，因此應(yīng)判定此方法清除的病毒量≥4 logs。

    （5）病毒滅活動(dòng)力學(xué)是非常重要的觀察指標(biāo)。如巴氏消毒法（60℃，10小時(shí)），如果病毒殘留量很快降到最低檢出限度值，說(shuō)明此方法滅活病毒效果很好。如果病毒滅活速率緩慢，在滅活結(jié)束時(shí)才達(dá)到最低檢出限度值，不能認(rèn)為是一個(gè)有效的病毒滅活方法。這就是說(shuō)，評(píng)價(jià)驗(yàn)證結(jié)果不能僅考慮病毒降低量，同時(shí)也要考慮病毒滅活動(dòng)力學(xué)。

    生產(chǎn)工藝去除/滅活病毒能力驗(yàn)證參照特定的去除/滅活病毒方法驗(yàn)證的要求進(jìn)行。需要特殊考慮的問(wèn)題有以下幾方面：

    （一）只對(duì)可能有去除/滅活病毒作用的生產(chǎn)步驟進(jìn)行驗(yàn)證。

    （二）模擬的生產(chǎn)工藝各種參數(shù)應(yīng)盡可能與實(shí)際的生產(chǎn)工藝相一致，如p、溫度、蛋白質(zhì)和其他組成成分的濃度、反應(yīng)時(shí)間、層析柱的柱床高度及流速與床高的比例、洗脫圖譜及該步驟的生產(chǎn)效果（如產(chǎn)量、比活性、組成成分）。應(yīng)分析生產(chǎn)工藝中各種參數(shù)的偏差對(duì)病毒去除/滅活效果的影響。

    （三）生產(chǎn)各步驟對(duì)不同類型病毒去除/滅活的選擇性。

    （四）核酸擴(kuò)增技術(shù)（如PCR）檢測(cè)病毒核酸的靈敏度比較高，但是該檢測(cè)技術(shù)最大的局限性是不能區(qū)別被滅活了還是未被滅活的病毒。因此該技術(shù)不能用于滅活病毒量的驗(yàn)證，只能用于生產(chǎn)過(guò)程中病毒去除量的驗(yàn)證。

    （五）通常在生產(chǎn)過(guò)程中去除/滅活病毒量是可以計(jì)算在清除病毒總量中，但不能認(rèn)定是有效病毒去除步驟。因?yàn)樯�產(chǎn)過(guò)程通常有一些變化，很難控制及驗(yàn)證，而且，病毒分配完全取決于病毒特異的理化性質(zhì)，這些理化性質(zhì)影響了病毒與凝膠介質(zhì)相互作用和沉淀的性質(zhì)。因此由于病毒表面特性的微小差異（如：糖基化），指示病毒與靶病毒分配形式可能完全不同。在實(shí)驗(yàn)室增殖的相關(guān)病毒可能在分配上與野生株不同。然而，如果病毒降低量可重復(fù)，如果影響病毒分配的各生產(chǎn)參數(shù)可以適當(dāng)?shù)卮_定和控制，所要的組份能可靠的與一般公認(rèn)的含病毒組份分開(kāi)，就可以符合有效步驟的標(biāo)準(zhǔn)（即，認(rèn)為是有效去除/滅活病毒步驟）。

    （六）驗(yàn)證的目的是為了確定生產(chǎn)工藝去除/滅活病毒的能力，獲得生產(chǎn)全過(guò)程中估計(jì)去除/滅活病毒的總量。一般降低的總量是各步降低病毒量的總和。但是由于病毒驗(yàn)證的局限性，如分步驟中病毒降低量≤1 log則不應(yīng)將其計(jì)算在總量中。

    以下幾種情況需進(jìn)行病毒去除/滅活方法的再驗(yàn)證：

    （一）首次生產(chǎn)者，需對(duì)生產(chǎn)工藝中特定的去除/滅活病毒方法進(jìn)行再驗(yàn)證；

    （二）采用新工藝或?qū)υ�有生產(chǎn)工藝進(jìn)行了重大改革時(shí)，需對(duì)生產(chǎn)工藝進(jìn)行清除病毒能力驗(yàn)證；對(duì)特定的去除/滅活病毒方法進(jìn)行去除/滅活病毒效果驗(yàn)證；

    （三）工藝改變但不屬重大工藝改革時(shí)，需對(duì)特定的去除/滅活病毒方法進(jìn)行再驗(yàn)證；

    （四）被滅活的中間品組成成分或p值發(fā)生改變時(shí)，需對(duì)特定的去除/滅活病毒方法進(jìn)行再驗(yàn)證。

   

    1．國(guó)家藥品監(jiān)督管理局授權(quán)中國(guó)藥品生物制品檢定所及其它認(rèn)定的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病毒去除/滅活效果的驗(yàn)證工作。

    2．血液制品生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)按本技術(shù)指導(dǎo)原則的要求對(duì)其生產(chǎn)工藝和特定的病毒去除/滅活方法進(jìn)行驗(yàn)證。如無(wú)條件，可委托其它單位進(jìn)行去除/滅活病毒效果的驗(yàn)證。

    3．血液制品生產(chǎn)企業(yè)在完成去除/滅活病毒效果驗(yàn)證后，向中國(guó)藥品生物制品檢定所提出驗(yàn)證申請(qǐng)，并附制品生產(chǎn)工藝、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、病毒滅活方法及其標(biāo)準(zhǔn)操作細(xì)則（SOP）、至少中試規(guī)模連續(xù)生產(chǎn)的三批病毒滅活前中間品（去除/滅活病毒前的樣品）及其制造記錄等相關(guān)資料。

    4．中國(guó)藥品生物制品檢定所對(duì)生產(chǎn)單位提交的驗(yàn)證申請(qǐng)及相關(guān)的技術(shù)資料進(jìn)行審核；對(duì)其提供的三批病毒滅活前的中間品進(jìn)行與病毒去除/滅活方法相關(guān)的參數(shù)（如：p、蛋白質(zhì)濃度、水分及穩(wěn)定劑含量、純度等）的檢測(cè)。

    5．中國(guó)藥品生物制品檢定所及授權(quán)認(rèn)定的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)生產(chǎn)單位提交的連續(xù)生產(chǎn)的三病毒滅活前的中間品進(jìn)行病毒滅活方法效果驗(yàn)證。授權(quán)認(rèn)定的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室在驗(yàn)證完成后將驗(yàn)證結(jié)果函告中國(guó)藥品生物制品檢定所。

    6．在病毒去除/滅活驗(yàn)證的同時(shí)或驗(yàn)證后，中國(guó)藥品生物制品檢定所對(duì)申報(bào)單位提供的連續(xù)生產(chǎn)的三批制品（批號(hào)可與病毒驗(yàn)證時(shí)報(bào)送的制品的批號(hào)不同，但必須是采用相同的生產(chǎn)工藝和病毒去除/滅活方法生產(chǎn)的制品）進(jìn)行全面質(zhì)量復(fù)核（按《中國(guó)生物制品規(guī)程》及有關(guān)的法定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行全檢，出具檢驗(yàn)報(bào)告）。

    7．采用新的病毒去除/滅活方法時(shí)，在資料審查及病毒滅活效果驗(yàn)證結(jié)束后，由中國(guó)藥品生物制品檢定所負(fù)責(zé)組織血液制品和病毒學(xué)等方面專家以及包括藥品審評(píng)中心在內(nèi)的相關(guān)部門的人員參加的技術(shù)論證會(huì)，對(duì)申報(bào)的病毒滅活方法進(jìn)行論證。

    8．驗(yàn)證結(jié)束后，中國(guó)藥品生物制品檢定所將去除/滅活病毒驗(yàn)證結(jié)果、綜合評(píng)價(jià)意見(jiàn)及三批制品檢定報(bào)告回復(fù)申報(bào)單位；