各省、自治區(qū)、直轄市藥品監(jiān)督管理局：

    為加強SARS診斷試劑、疫苗以及防治藥物篩選研發(fā)工作的管理，規(guī)范技術(shù)研究及實驗方法，確保研究結(jié)果真實可靠，我局組織制定了《SARS病毒滅活疫苗臨床前研究技術(shù)要點》、《細胞模型篩選抗SARS病毒藥物試驗技術(shù)要求》、《SARS診斷試劑生產(chǎn)研制技術(shù)要求》及《SARS病毒毒株資料登記表》等技術(shù)要求，現(xiàn)予印發(fā)，請從事SARS防治藥物研發(fā)的單位遵照執(zhí)行，并就相關(guān)問題通知如下：

    一、從事SARS疫苗研究、診斷試劑研制和有關(guān)藥物篩選等工作的單位，在執(zhí)行相關(guān)技術(shù)要求的同時，必須嚴格按照科學(xué)技術(shù)部、衛(wèi)生部、國家食品藥品監(jiān)督管理局和國家環(huán)境保護總局四部局聯(lián)合頒發(fā)的《關(guān)于印發(fā)〈傳染性非典型肺炎病毒實驗室暫行管理辦法〉和〈傳染性非典型肺炎病毒的毒種保存、使用和感染動物模型的暫行管理辦法〉的通知》（國科發(fā)農(nóng)社字〔2003〕129號）要求保存和使用SARS病毒毒株，任何單位不得擅自進行毒株的轉(zhuǎn)讓。因SARS病毒毒株保存或者使用不當(dāng)引起嚴重后果者，將承擔(dān)相應(yīng)的法律責(zé)任。

    二、各藥物研究開發(fā)單位應(yīng)按照《SARS病毒毒株資料登記表》的要求整理有關(guān)毒株的詳細資料，于2003年7月31日前報中國藥品生物制品檢定所（北京天壇西里2號，郵編100050；聯(lián)系人：董關(guān)木；聯(lián)系電話：010-67058428）。未按規(guī)定要求提交SARS病毒毒株資料的，國家食品藥品監(jiān)督管理局將不受理其研發(fā)制品的注冊申報和審批。

    三、中國藥品生物制品檢定所接到各單位報送的SARS病毒毒株資料后，應(yīng)及時審核并將審核意見和進行藥物研究用毒種的基本情況，書面報國家食品藥品監(jiān)督管理局。

    四、請各省、自治區(qū)、直轄市藥品監(jiān)督管理局盡快將本通知轉(zhuǎn)發(fā)至轄區(qū)內(nèi)從事SARS防治藥物研究開發(fā)單位。

    特此通知

    附件：1.SARS病毒滅活疫苗臨床前研究技術(shù)要點

   

    國家食品藥品監(jiān)督管理局

    二○○三年七月一日

    隨著對非典型肺炎的病原學(xué)、流行病學(xué)、診斷和治療等學(xué)科進行全面深入的研究，在各領(lǐng)域已取得重要進展，尤其是確定了SARS病毒為其病原體，已成功分離到多株SARS病毒，并已驗證其能在Vero細胞和2BS等細胞系中培養(yǎng)增殖，這為研制疫苗提供了基礎(chǔ)和基本條件。但是由于SARS病毒的研究有待進一步深入，疫苗的研制尚存在很多的不確定因素。為使SARS病毒滅活疫苗的臨床前研究工作科學(xué)規(guī)范，特制定SARS病毒滅活疫苗臨床前研究考慮要點。

    一、毒種

    研究本疫苗所用的毒種須證明為SARS病毒，如該毒種分離自人體，須提供以下資料

    （一）病毒株名稱及來源

    1.名稱

    2.宿主情況：

    （1）病人姓名、年齡、性別、民族、家庭住址；

    （2）發(fā)病地點、發(fā)病日期；

    （3）收住入院日期、臨床確診日期、實驗室確診日期；

    （4）病人病程及病人轉(zhuǎn)歸：死亡、痊愈、是否有后遺癥；

    （5）毒株分離原樣本：

    咽試子、漱口液、痰液、血液、糞便或尸解標(biāo)本組織名稱；

    （6）取樣日期；

    （7）取樣時病人的病期；

    （8）取樣地點；

    （9）病人是否留有恢復(fù)期血清；

    如有：采血日期（病期）和血清量；

    鑒于人類咽試子、漱口液、痰液、糞便等樣品難免污染其他外原因子，因此建議盡可能采用病人血液分離的病毒株。

    （二）毒株分離過程

    1.用細胞分離病毒，須提供所用細胞名稱、代次、來源和細胞無菌檢測、外原因子檢測等資料；鑒于Vero E6細胞的生物學(xué)特性，用Vero E6細胞分離的SARS病毒不能直接用于疫苗生產(chǎn)用毒種，須將Vero E6細胞的適應(yīng)株重新轉(zhuǎn)適應(yīng)到Vero細胞或二倍體細胞株的毒種方能用于生產(chǎn)，因此建議盡可能使用直接以Vero細胞或二倍體細胞株分離的毒種。

    2.通過動物分離病毒，須提供所用動物名稱、動物品系、動物級別、動物年齡和制備毒種的動物臟器名稱等資料；如再適應(yīng)到細胞，則還須提供1項所述的細胞資料。

    （三）病毒分離傳代特性

    樣品處理方法、首次盲傳確證病毒陽性代次、病毒確證檢定方法、每代培養(yǎng)天數(shù)、病毒滴度、滴定方法、動物是否發(fā)病或死亡等資料。

    （四）毒種建立和保存

    原始毒種代次、毒種病毒滴度、毒種添加的保護劑的名稱和濃度、毒種存儲條件。

    毒種批的建立應(yīng)按《中國生物制品規(guī)程》疫苗毒種要求進行，應(yīng)建立原始毒種、主毒種和工作毒種批三級毒種庫，主種子和工作種子批還須有毒種的限定代次的資料，以證明主種子和工作種子批在規(guī)定代次內(nèi)的生物學(xué)特性與原始毒種一致。

    （五）毒種的檢定

    1.毒種的鑒別試驗

    應(yīng)提供檢定方法、檢定日期、檢定結(jié)果等資料，建議采用下述方法進行鑒別試驗：

    （1）可使用確診為SARS病人的恢復(fù)期高效價血清中和病毒。

    （2）測定中和前后的病毒滴度。

    （3）應(yīng)有病毒株的核酸全序列分析的資料，包括序列測定的方案、測定方法和測定結(jié)果，測定結(jié)果應(yīng)附核酸序列圖、推導(dǎo)的氨基酸序列圖、種系發(fā)生樹圖等以進一步證明為SARS冠狀病毒。

    2.毒種的無菌試驗

    應(yīng)根據(jù)《中國生物制品規(guī)程》疫苗生產(chǎn)用毒種的要求進行無菌試驗檢查。

    3.毒種的外源因子檢查

    應(yīng)用證明為SARS病毒感染的單人份病人血清中和本病毒。完全中和病毒后（如不能一次中和，可用另一病人血清再一次中和后）按下列方法進行動物和細胞檢查。

    （1）動物試驗法

    小鼠    取15-20g小鼠至少10只，用經(jīng)中和后的病毒懸液，每只腦內(nèi)接種0.03ml，腹腔接種0.5ml。至少觀察21天。解剖所有在試驗24小時后死亡或有患病體征的小鼠，為了檢查病毒感染的證據(jù)，直接肉眼觀察其病理改變，并將有病變的相應(yīng)的組織懸液通過腦內(nèi)和腹腔接種另外至少5只小鼠并觀察21天。如果沒有小鼠表現(xiàn)出病毒感染現(xiàn)象，則病毒種子符合要求。在觀察期內(nèi)至少有80%最初接種的小鼠存活試驗才有效。

    乳鼠    出生后24小時以內(nèi)的乳鼠，至少10只，用經(jīng)中和后的病毒懸液，腦內(nèi)接種0.01ml，腹腔接種至少0.1ml。每天觀察，至少14天。解剖所有在試驗24小時后死亡或有患病體征的小鼠，直接肉眼觀察其病理改變，并取有病變的相應(yīng)的組織和腦、脾制備成懸液腦內(nèi)和腹腔接種另外至少5只小鼠并每天觀察，觀察14天。如果沒有小鼠表現(xiàn)出有病毒感染現(xiàn)象，該病毒種子通過試驗。在觀察期內(nèi)至少有80%最初接種的小鼠存活試驗才有效。

    （2）細胞培養(yǎng)法

    ●非血吸附病毒檢查

    中和后的病毒懸液，還應(yīng)分別接種于人源、猴源和生產(chǎn)用的同種不同批的細胞。如果是利用人二倍體細胞生產(chǎn)的，還應(yīng)接種另外一株人二倍體細胞。每種細胞最少接種6瓶，每瓶病毒懸液接種量不少于培養(yǎng)液總量的25%。于36±1℃培養(yǎng)，觀察二周，或最后一次收獲病毒液時間檢查是否有CPE出現(xiàn)。未見CPE為陰性。

    ●血吸附病毒檢查

    于第6-8天和第14天，每種細胞分別各取出2瓶進行血吸附，一瓶放置2-8℃，一瓶放置20-25℃，30分鐘后顯微鏡下觀察，未見血球吸附現(xiàn)象為陰性。

    特別注意：鑒于我國實驗室條件和所用細胞的不確定因素，用于分離病毒的細胞常常污染支原體，而細胞和病毒一旦污染支原體很難清除，為此，提醒對使用的毒種須高度重視，徹底查清毒種是否確已污染支原體，以免所選毒種不符合生產(chǎn)疫苗用毒種，浪費人力、物力、時間和資源。

    4.毒種的病毒滴度

    鑒于目前的研究資料顯示，SARS病毒在Vero細胞中的復(fù)制滴度一般可達10⁸，在二倍體細胞中為10⁶左右，用于疫苗研究的毒種應(yīng)分別達到上述要求。

    5.毒種免疫原性檢查

    鑒于目前尚無測定疫苗免疫原性的有效方法和標(biāo)準(zhǔn)，建議以實驗性滅活疫苗（即用已建立的毒種庫制備的滅活病毒液）單次或多次免疫動物后采血清測定中和抗體滴度，測定方法應(yīng)為蝕斑形成減少法或細胞病變抑制法，可能時應(yīng)對所測抗體的種類進行分析。用于中和抗體測定的病毒株應(yīng)為非同源株，免疫用動物可考慮家兔、小鼠、豚鼠或其他敏感動物。如有條件時也可測定疫苗的ED₅₀。

    6.疫苗候選株病毒的純化問題

    新分離的病毒往往是群體病毒毒種，難免存在不同特性的病毒，如毒種病毒滴度和免疫原性未達要求，必要時可考慮用終末稀釋法或蝕斑形成法挑斑反復(fù)多次純化。滅活疫苗的研制，如毒種病毒滴度和免疫原性能達到基本要求，可用現(xiàn)有毒種直接制備實驗性疫苗，無須純化。

    7.毒種的其他檢定

    按《中國生物制品規(guī)程》疫苗生產(chǎn)用毒種的要求進行。

    二、疫苗生產(chǎn)用細胞

    鑒于目前SARS病毒對各種細胞的敏感性研究，以Vero E6細胞最好，Vero細胞和二倍體細胞次之。但Vero E6細胞不能用于生產(chǎn)，可選擇Vero細胞、和/或二倍體細胞進行研究。

    Vero細胞、二倍體細胞均為傳代細胞，因此須建立三級細胞庫。這兩種細胞建立細胞庫和各細胞庫的各項檢定應(yīng)按《中國生物制品規(guī)程》“生物制品生產(chǎn)用動物細胞制備及檢定規(guī)程”項下的相應(yīng)要求進行。

    Vero細胞是由非洲綠猴腎建立的傳代細胞系，至170代以后已有明顯的致瘤性，一般使用的疫苗生產(chǎn)終末安全代次為160代以前，建議使用Vero細胞研制疫苗的機構(gòu)應(yīng)注意該細胞的資料。

    三、生產(chǎn)工藝研究

    （一）生產(chǎn)工藝的主要技術(shù)參數(shù)

    1.病毒與細胞的接種比例，MOI的最佳參數(shù)。

    2.細胞培養(yǎng)和病毒培養(yǎng)的最佳溫度、培養(yǎng)時間和收獲時間。

    3.病毒液的收獲

    鑒于Vero作培養(yǎng)基質(zhì)時，后續(xù)純化工藝去除細胞DNA時的困難，因此建議不作細胞凍化以提高病毒收獲的做法。

    4.滅活或裂解條件及滅活效果的驗證

    鑒于SARS病毒的強感染和強傳播特性，滅活劑的選擇和滅活效果的驗證尤為重要，建議如下：

    ●滅活劑

    根據(jù)其他疫苗的滅活經(jīng)驗，一般情況下可采用甲醛、β-丙內(nèi)酯或其他有效的滅活劑，如選擇甲醛，其濃度、滅活的作用時間、作用溫度、p等條件對疫苗的抗原的活性具有較大的影響，在研究中應(yīng)引起注意；

    如用β-丙內(nèi)酯應(yīng)使用95%以上濃度的新試劑，β-丙內(nèi)酯保存時間過長引起自身聚合，影響滅活效果。β-丙內(nèi)酯由于能在疫苗液體中完全水解，不必考慮在成品疫苗中的殘留，因此可考慮在純化前低劑量預(yù)滅活一次，提高生產(chǎn)工序時的安全性，在純化后再滅活一次以確保完全滅活。

    ●滅活效果的驗證

    提供病毒滅活驗證的詳細資料�？刹捎妹舾屑毎鸙ero E6盲傳3代，每代用直接免疫熒光驗證無活病毒。

    5�辈《疽旱臐饪s和/或活性抗原的提取純化，可考慮用膜過濾法濃縮和柱層析法或區(qū)帶離心法純化或其他有效方法。建議參照其他純化疫苗的要求，對疫苗的總蛋白含量進行控制。

    6.佐劑

    目前能用于疫苗的佐劑僅為鋁佐劑，而鋁佐劑通常使疫苗產(chǎn)生的抗體滯后，且增加注射局部的副反應(yīng)機率。如疫苗的抗原量能滿足免疫的需要，建議不加佐劑。

    （二）滅活疫苗的安全性（免疫感染增強作用）

    鑒于呼吸道病毒感染的疫苗預(yù)防（麻疹病毒、呼吸道合胞病毒等）易產(chǎn)生滅活疫苗導(dǎo)致免疫感染增強的病理反應(yīng)，因此，本滅活疫苗須排除免疫感染增強作用的潛在危險，為本滅活疫苗的研究、實驗和今后的安全使用提供依據(jù)。

    但是目前沒有明確的實驗動物模型可以驗證有無免疫感染增強作用，為此建議：可用猴體接種滅活疫苗后再攻擊SARS病毒，一定時間后測定猴體是否產(chǎn)生病毒血癥、臟器是否減少或無病毒抗原、以及作組織病理學(xué)和免疫病理學(xué)等檢查，可以得到初步的證據(jù)。另外也可考慮用家兔、小鼠等別的動物進行免疫感染增強作用的初步驗證。

    四、生產(chǎn)的安全性問題

    鑒于SARS病毒的強傳播和強感染性的生物學(xué)特性，生產(chǎn)工藝應(yīng)嚴格按活病毒和滅活后兩部分分開進行，活病毒操作區(qū)必須在P3以上生物安全條件下進行，嚴格執(zhí)行國家的有關(guān)規(guī)定。

    五、其他

    （一）按我國《藥品注冊管理辦法》中預(yù)防用生物制品的技術(shù)要求完成相關(guān)的研究。

    （二）本技術(shù)要點將根據(jù)對SARS研究的進展情況適時進行修訂。

         

    新近發(fā)現(xiàn)的非典型肺炎的病原SARS病毒，目前尚沒有理想的動物模型可用于對抗SARS病毒藥物的篩選。為此用細胞模型篩選研究抗SARS病毒的藥物，對評價藥物抗病毒活性或效果具有重要提示價值。為規(guī)范細胞模型抗SARS病毒藥物的篩選研究，制定本技術(shù)要求。

    本技術(shù)要求適用于化藥、中藥、生物制品等擬用于SARS治療或預(yù)防藥物（不包括預(yù)防用疫苗），并將根據(jù)SARS病毒學(xué)研究的進展適時修訂。

    一、試驗材料要求

    （一）病毒

    1.毒株：應(yīng)采用SARS流行期臨床分離且經(jīng)相關(guān)部門確證的SARS病毒毒株（建議選用2-3株）。

    2.毒種庫：試驗前將病毒先在敏感細胞上傳數(shù)代，增加毒力，待毒力穩(wěn)定后，收獲病毒分裝一定數(shù)量的小管，在-80℃低溫冰箱或液氮冷凍保存?zhèn)溆谩?/div>

SARS診斷試劑生產(chǎn)研制技術(shù)要求

SARS病毒毒株資料登記表